ارزیابی تنوع ژنتیکی و شناسایی برخی ناخالصی های زعفران با استفاده از روش های مبتنی بر pcr

زعفران به عنوان گرانترین ادویه جهان از کلاله‎های خشک گیاه crocus sativus به دست می‎آید و به طور عمده به عنوان رنگ و طعم دهنده در صنایع غذایی و به علت داشتن ترکیبات فعال در پزشکی کاربرد دارد. در این مطالعه تنوع ژنتیکی میان 28 ژنوتیپ زعفران که از مناطق مختلف ایران جمع آوری شده بود، با استفاده از نشانگر srap ارزیابی شد. 19 ترکیب آغازگری در مجموع 147 قطعه چندشکل با میانگین 74/7 قطعه و میانگین pic برابر 15/0 برای هر ترکیب آغازگری تکثیر نمودند. تجزیه خوشه ای با استفاده از الگوریتم اتصال همسایه (nj)، ژنوتیپ ها را به چهار گروه تقسیم نمود که اغلب ژنوتیپ ها در یک گروه عمده قرار گرفتند. تجزیه به مولفه های اصلی (pca) نیز نشان داد که استفاده از روش تجزیه خوشه ای به منظور بررسی روابط ژنتیکی ژنوتیپ های مورد مطالعه مناسب تر است. ارتباط نزدیک آشکار شده در میان ژنوتیپ‎های این مطالعه می‎تواند به دلیل تکثیر رویشی، انتخاب بهترین‎ ژنوتیپ‎ها به وسیله انسان و وجود دامنه ژنتیکی کم ژنوتیپ های زعفران باشد. نتایج به دست آمده مشخص نمود که نشانگر srap توانایی لازم برای تفکیک ژنوتیپ های زعفران را ندارد. به منظور طراحی آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر زعفران از نشانگر rapd استفاده گردید. 25 آغازگر تست شد که شش آغازگر نوارهایی با اندازه‎های متفاوت و تکثیر مناسب ایجاد نمودند که جهت توالی یابی و طراحی آغازگرهای اختصاصی همسانه سازی شدند. پس از بهینه سازی شرایط pcr برای آغازگرهای طراحی شده، آغازگرها تحت شرایط مخلوط بودن dna زعفران با گلرنگ و ذرت نیز مورد آزمایش قرار گرفتند. نتایج حاصل از این آزمایش تکثیر اختصاصی dna زعفران را تائید نمود. با استفاده از توالی‎های its نیز جفت آغازگر اختصاصی برای گلرنگ طراحی گردید و مورد آزمایش قرار داده شد که نتایج به دست آمده تکثیر اختصاصی گلرنگ را تحت شرایط مخلوط بودن زعفران و گلرنگ نشان داد. از آنجایی که نتایج حاصل از pcr به صورت کیفی بیان می شود (وجود یا عدم وجود نوار)، برای کمی سازی نتایج آزمایش از واکنش real time pcr استفاده گردید. واکنش real time pcr با استفاده از آغازگرهای اختصاصی طراحی شده برای زعفران با استفاده از توالی‎ قطعات dna زعفران تکثیر شده با آغازگرهای rapd و با استفاده از کیت سایبرگرین انجام شد. به دلیل ناشناخته بودن منشا قطعات تکثیر شده با آغازگرهای rapd و حساسیت بالای واکنش real time pcrبه تکثیر غیر اختصاصی در مقادیر کم و همچنین احتمال تکثیر غیر اختصاصی محدود در روش سایبرگرین، واکنش real time pcrنتایج مورد اطمینان را نشان نداد. بنابراین استفاده از آغازگرهای طراحی شده از نواحی کد شونده ژنوم زعفران جهت تکثیر اختصاصی در واکنش real time pcr و کمیت سنجی زعفران در انواع مخلوط آن با نمونه های تقلبی، پیشنهاد می شود.